CLONING VECTOR

 प्रत्येक कोशिका में वह अनुवांशिक पदार्थों को नष्ट करने की प्रवृत्ति पाई जाती है अतः किसी भी जीन अथवा डीएनए के टुकड़े को सीधे किसी कोशिका के अंदर प्रविष्ट नहीं कराया जा सकता। बल्कि, पहले इसे किसी वाहक अथवा वेक्टर पर जोड़ा जाता हैं। तत्पश्चात ही इसे कोशिका में प्रविष्ट कराया जा सकता है एक आदर्श क्लोनिंग वाहक में निम्न गुण पाए जाने चाहिए-- 

1. इसमें व्दिगुणन की क्षमता होनी चाहिए

2. इसका अणुभार कम होना चाहिए ताकि इस पर बड़े एवं अधिक अणुभार वाले जीन को भी जोड़ा जा सकें।

3. वाहक का विलगन तथा शुद्धीकरण आसान होना चाहिए।

4. पोषक कोशिका के अंदर वाहक अथवा रिकांबिनेन्ट डीएनए का विनिष्टिकरण नहीं होना चाहिए।

आनुवांशिक अभियांत्रिकी में प्रमुखत निम्न प्रकार के क्लोनिंग वाहको का उपयोग होता हैं

1. प्लाज्मिड   यह जीवाणुओं में पाया जाने वाला अतिरिक्त गुणसूत्रीय अनुवांशिक पदार्थ है यह हमेशा मुख्य गुणसूत्र से छोटा होता है जिसमें स्वतः व्दिगुणन की क्षमता पाई जाती हैं । PBR³²² PUC ई. कोलाई जीवाणुओं में पाए जाने वाले प्रमुख प्लाज्मिड्स  हैं। इसी प्रकार एग्रो बैक्टीरिया ट्यूमिफेसिएन्स नामक जीवाणु में Ti प्लाज्मिड पाया जाता है उसका उपयोग पादप अनुवांशिकी अभियांत्रिकी में बड़े पैमाने पर हो रहा हैं ं

The tendency to destroy that genetic material is found in every cell, so no gene or piece of DNA can be directly inserted inside a cell. Rather, it is first added to a carrier or vector. Only then can it be introduced into the cell. An ideal cloning carrier should have the following properties-

 1. It should have the ability to multiply

 2. Its molecular weight should be low so that genes of large and high molecular weight can also be added to it.

 3. The separation and purification of the carrier should be easy.

 4. There should be no specificization of carrier or recombinant DNA inside the host cell.

 The following types of cloning carriers are mainly used in genetic engineering

 1. Plasmid: This is the extra chromosomal genetic material found in bacteria, it is always smaller than the main chromosome, in which the ability to self-diplom is found. PBR³²² PUC are the major plasmids found in E. coli bacteria. Similarly, Ti plasmid is found in a bacterium called Agro bacteria tumifaciens, it is being used extensively in plant genetic engineering.

pBR322

Selection marker

ampR  एंपीसिलीन pBR322 का एक एंटीबायोटिक रेजिस्टेंट जीन हैं यह एंजाइम की सतह से बंध कर   उसकी क्रियाविधि को रोक देता हैं Cell Wall की संश्लेषण को रोक देता हैं 

tetR यह जीवाणुओं में प्रोटीन संश्लेषण की क्रिया को रोककर जीवाणुओं की वृद्धि को प्रभावित करता है तथा सेल मेंब्रेन को नष्ट कर देता हैं यह राइबोसोम की 30s सब यूनिट से जुड़कर amino-acyl tRNA को amino acid activation site (A site) से नहीं जोड़ने देता हैं और यह राइबोसोम की बड़ी सब यूनिट 50 ऐसे भी जुड़ जाता हैं

Ori site (origin of replication) इस स्थान पर डीएनए replication होता है तथा प्लाज्मिड जीवाणु कोशिका के अंदर अपनी संख्या को बढ़ाता हैं 

 

AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

विषाणु (virus)  :-  कुछ virus host cell में lysogenic life cycle प्रकार का जीवन चक्र प्रदर्शित करते हैं यह पोषक कोशिकाओं के लिए हानिकारक नहीं होते इसके अनुवांशिक पदार्थ पर बाहरी gene को जोड़ा जा सकता है ऐसे वायरस जब पोषक पर संक्रमण करते हैं तो उसके अनुवांशिक पदार्थ के साथ बाहरी जीन भी पोषक में प्रविष्ट हो जाते हैं जीवाणुभोजी का उपयोग जीवाणुओं में कॉलीफ्लावर मोजैक वायरस cauliflower mosaic virus का उपयोग पौधों में सिमियन वायरस - 40 का उपयोग चूहों में herpes तथा एडिनोवायरस का उपयोग मनुष्य की अनुवांशिक अभियांत्रिकी में आसानी से किया जा सकता हैं ।

Virus: - Some viruses exhibit a lysogenic life cycle type of life cycle in the host cell, it is not harmful to the host cells, external genes can be added to its genetic material, when such viruses infect the host cell, its Along with the genetic material, foreign genes are also introduced into the nutrients Bacteriophage is used in bacteria Cauliflower mosaic virus is used in plants Simian virus-40 is used in rats, herpes and adenovirus can be used easily in genetic engineering of humans. 

Cosmids and phagemids

Cosmids कॉस्मिड  एक प्रकार का हाइब्रिड प्लास्मिड है जो वायरस में पाया जाता हैं जिसमें लैम्ब्डा फेज कॉस अनुक्रम होता है। इनका आकार छोटा होता है तथा रिस्ट्रिक्शन एंजाइम द्वारा काटे जाने पर आवश्यक रूप से इनके दोनों किनारे पर cohesive or nicked ends एकल क्षार क्रम उत्पन्न होते हैं आनुवंशिक इंजीनियरिंग में उन्हें अक्सर क्लोनिंग वेक्टर के रूप में उपयोग किया जाता है। कॉस्मिड का उपयोग जीनोमिक लाइब्रेरी के निर्माण के लिए किया जा सकता है। उन्हें पहली बार 1978 में कोलिन्स और होन द्वारा वर्णित किया गया था।

Phagemids एक संयुक्त वाहक है जिसे जीवाणुओं में पाए जाने वाले प्लाज्मिड और जीवाणुभोजी बैक्टीरियोफेज के डीएनए को मिलाकर बनाया जाता हैं

 Cosmids 

Cosmids are a type of hybrid plasmid found in viruses that contain the lambda phage cos sequence.  They are small in size and, when cut by restriction enzymes, necessarily produce single base sequences on either side of their cohesive or nicked ends, they are often used as cloning vectors in genetic engineering.  Cosmids can be used to build genomic libraries.  They were first described in 1978 by Collins and Hohn.

Phagemids are a composite carrier made by mixing plasmid found in bacteria and the DNA of bacteriophage bacteriophage.

Artificial chromosome कृत्रिम गुणसूत्र 

इनका उपयोग स्तनधारियों के अनुवांशिक अभियांत्रिकी में खासकर ज्यादा होता है यह यूकैरियोटिक गुणसूत्रों के नॉनकोडिंग भाग जैसे टीलोमीटर्स telomeres को जोड़कर बनाया जाता है | इन्हें जीवाणुओं में BAC बैक्टीरियल आर्टिफिशियल क्रोमोजोम , Yeast में  YAC (yeast artificial chromosome ) तथा स्तनधारियों में MAC  mammalian artificial chromosome  कहा जाता हैं।

artificial chromosome

They are particularly used in the genetic engineering of mammals. They are made by joining noncoding parts of eukaryotic chromosomes such as telomeres to telomeres. These are called BAC bacterial artificial chromosome in bacteria, YAC (yeast artificial chromosome) in yeast and MAC mammalian artificial chromosome in mammals.

Taq polymerase :- यह एक DNA पाॅलीमेरेज  एंजाइम हैं , जो thermus aquaticus में पाया जाता हैं |  यह 72°C से अधिक तापक्रम पर भी क्रियाशील रहता है। इसका उपयोग polymerase chain reaction में होता है जिसकी सहायता से अत्यंत कम मात्रा में उपलब्ध डीएनए को बढ़ाया जाता है। 

Reverse transcriptase :- इस एंजाइम की सहायता से RNA से DNA बनाया जा सकता हैं । इसकी खोज retroviruses में टेमिन तथा बाल्टिमोर द्वारा की गई थी । इस प्रकार के DNA को complementary DNA कहते हैं ।

Artificial genes :- अनुवांशिक अभियांत्रिकी में जींस को एक तंत्र से दूसरे जैविक तंत्र में प्रविष्ट कराया जाता है । अतः जींस आनुवंशिक अभियांत्रिकी के लिए प्रमुख पदार्थ हैं । इन्हें  स्वयं जीव से प्राप्त किया जाता है अथवा विभिन्न कृत्रिम विधियों द्वारा न्यूक्लियोटाइड्स की सहायता से बनाया जा सकता है । 

DNA ligase :- इस एंजाइम का उपयोग DNA के दो खंडों को जोड़ने के लिए किया जाता है।

Alkaline phosphatase :- यह  DNA के 5' किनारे से फास्फेट समूह को हटाने में उपयोग में लाया जाता हैं ।

Taq polymerase: - It is a DNA polymerase enzyme, which is found in Thermus aquaticus. It remains active even at temperatures above 72°C. It is used in polymerase chain reaction, with the help of which DNA is amplified in very small quantities.

 Reverse transcriptase:- DNA can be made from RNA with the help of this enzyme. It was discovered in retroviruses by Temin and Baltimore. This type of DNA is called complementary DNA.

 Artificial genes: - In genetic engineering, genes are introduced from one system to another biological system. Therefore, genes are the main material for genetic engineering. These can be obtained from the organism itself or can be made with the help of nucleotides by various artificial methods.

 DNA ligase:- This enzyme is used to join two segments of DNA.

 Alkaline Phosphatase: It is used to remove the phosphate group from the 5' end of DNA.